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winner802光子相关纳米粒度仪的应用

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生化诊断是医院检验科最为常见的诊断平台，具有准确度高、精密度好及试剂性能稳定等特点，而胶乳增强免疫比浊法又是生化诊断平台中运用最为广泛的一种方法，能大大提高生化检验的分析灵敏度，在临床诊断中得到了广泛的运用。

胶乳致敏颗粒的制备过程如下：将抗体与聚苯乙烯纳米羧基微球在特定的缓冲液中孵育，加入一定量羧基活化剂，使得IgG分子N-端的氨基与微球表面的羧基发生共价偶联，形成牢固的酰胺键，最终微球表面被包被了一层IgG，可与人血清样本中相应的抗原发生抗原抗体反应而致敏。然而在包被抗体过程中，由于所处缓冲体系的变化、包被IgG等电点与Buffer PH相近等原因，微球表面原先的电荷平衡会被打破，导致纳米微球粒子之间会发生一些可逆性的聚集，使得纳米微球粒径增大为裸球的几倍甚至数十倍，直至微球聚集沉淀。同时，由于颗粒之间的聚集程度不一致，导致整个胶体溶液体系的均一性很差，分散度不好。

粒径增大及分散度变差的胶乳致敏颗粒会严重影响试剂的性能，如灵敏度降低、线性范围变窄及稳定性变差等。这时，除了选择合适的胶乳储存液之外，大家还需要用超声波细胞破碎机将团聚的胶乳颗粒用超声波打散并实时监测其粒径及分散指数的变化，直至其下降到能满足试剂相应的性能指标要求为止。然而，如果超声能量过大或者时间过长，虽然能使微球粒径及分散指数降至很低的水平甚至接近裸球的水平，但是超声波的高能量会对微球表面包被的IgG分子有一定的破坏，使得致敏胶乳颗粒失效。综上所述，大家在超声过程中需要不断监测胶乳颗粒粒径及分散指数的变化，找到一个合适的范围，既能保证试剂的各项性能指标要求，又能及时终止超声过程以减少其对IgG分子的破坏，保证抗体的生物活性。

本研究以人血清肌红蛋白检测用致敏胶乳颗粒的制备过程为例，通过大量实验数据阐明在胶乳颗粒制备过程中粒径及分散指数的控制对最终试剂性能的影响。

本研究中用到的主要原料及仪器如下：

原料及仪器名称	厂家	规格/批号/型号
羊抗人肌红蛋白多克隆抗体	北京阿匹斯生物生物技术有限企业	批号：20160506
聚苯乙烯羧基纳米微球	JSR Life Sciences	规格：P0219
超声波细胞破碎机	南京先欧仪器制造有限企业	型号：XO-900D
粒径分析仪	济南微钠	型号：Winner 802
全自动生化分析仪	长春迪瑞	CS-1200

本研究的实验方法如下：将制备好的人血清肌红蛋白检测用致敏胶乳颗粒进行冰浴超声，每隔10min取样测试粒径（单位为nm）及分散指数（以粒径仪测值*10000表示）（粒径仪事先进行校准），实验结果如下：

由上图可知，随着超声时间的延长，粒径及分散度迅速下降，约20min之后达到一个平台期，粒径及分散度下降缓慢。

选取每一个超声时间点的致敏胶乳颗粒，测试试剂线性范围实验结果如下：

从以上实验结果可以看出，随着超声时间延长，致敏胶乳颗粒的粒径及分散指数逐渐降低，对应试剂的线性范围逐渐变宽，分析原因如下：当胶乳致敏颗粒粒径及分散度较大时，在体系中颗粒聚集在一起，反应梯度不明显，整体吸光度值都很高；超声打散胶乳颗粒后，接近单个粒子的胶乳体系与抗原反应时能形成很强的浊度，是线性范围变得很宽，且打散后的胶乳颗粒抗体暴露的更完全，免疫反应很强，吸光度值更高；继续超声，虽然粒径及分散度降的更低，但包被的IgG分子一定程度上被超声波的高能量所破坏，导致线性范围变窄，低值灵敏度及高值可报告范围均变差。

同样选取每个超声时间点的致敏胶乳颗粒，测试试剂在37℃热环境下的稳定性，测试一个月，实验结果如下：

从以上实验结果可以看出，随着超声波打散的进行，致敏胶乳颗粒的粒径及分散指数逐渐降低，试剂的热稳定性也呈现出一定的规律：0min及10min两组由于粒径过大，胶乳颗粒直接聚集沉淀，无法测试稳定性；20min由于胶乳颗粒没有处于完全打散状态，颗粒会有逐步缓慢聚集的过程，稳定性测试表现为上升的趋势并在28天的时候聚集沉淀；30minn时胶乳颗粒的粒径及分散度处于最佳的水平，试剂性能较为稳定；随着超声时间的延长，IgG分子的破坏越来越明显，导致试剂不稳定。

综上所述，在致敏胶乳颗粒制备过程中需要通过超声波打散凝集的胶乳，而粒径及分散指数的监测可以作为衡量超声效果的很好指标。在本研究中，肌红蛋白致敏胶乳颗粒制备的最佳超声时间是30min，此时的粒径为274nm，分散指数为0.0426，此时的试剂性能最佳。

然而，不同的项目可能表现为不同的超声时间、最佳粒径及分散指数，但是都会有以下的规律：致敏胶乳颗粒粒径及分散指数过大时，整个体系不稳定，胶乳颗粒可能会聚沉，试剂性能较差；粒径及分散指数过低时，高强度的超声波可能会破坏IgG分子的生物学结构和功能，从而导致试剂性能变差。所以大家需要通过超声控制合理的粒径及分散指数，使得试剂性能达到一个最佳状态。在每一个项目的研发上，大家可能都需要找到致敏胶乳颗粒的最佳粒径及分散指数，以及时终止超声过程，保证试剂的最佳性能。

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